淫羊藿素对系统性红斑狼疮Foxp3/IL17a调控作用与分子机制及其治疗MRL/1pr狼疮鼠的实验研究

【摘要】系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus,SLE)是一种多器官、多系统受累的自身免疫性疾病。其确切病因及发病机理尚不十分清楚,研究表明,CD4+T细胞在SLE自身免疫反应的启动、维持以及器官损害方面发挥重要作用。调节性T(Treg)细胞和Th17细胞作为特殊的T细胞亚群,其平衡对维持免疫内环境稳定意义重大。大量实验证明,Treg细胞和Th17细胞失衡与自身免疫性疾病特别是SLE的发生发展密切相关[1]。SLE的治疗目前尚无有效根治办法。尽管恰当的应用抗疟药、糖皮质激素、免疫抑制剂,以及生物制剂可使大多数患者达到病情缓解,但是部分患者对这些药物不敏感、部分患者容易复发,部分患者对这些药物的副作用难以耐受。因此,积极探寻新的治疗方法、治疗药物刻不容缓。淫羊藿为传统中草药,来源于小檗科淫羊藿属植物。淫羊藿素(icaritin,ICT)是淫羊藿的主要成分淫羊藿苷的体内代谢产物。在传统医学中淫羊藿是一种补肾壮阳的中药,而现代药理研究表明,淫羊藿有效成分及其提取物具有广泛的生理活性[2]。Zhang等在研究ICT抑制K562细胞株细胞增殖的过程中发现ICT具有下调雌激素受体活性[3]。Li等发现ICT能够抑制T细胞活化从而延长老鼠接受皮肤同种异体移植后的寿命[4]。雌激素受体以及T细胞异常活化在SLE的发病过程中起了重要作用[5]。但是ICT对SLE的治疗作用,国内外尚无相关报道。在此背景下,我们进行了体外用ICT作用于SLECD4+T细胞以及体内治疗MRL/lpr狼疮鼠的探索。通过体外实验发现ICT能够调控SLECD4+T细胞Foxp3/IL17a平衡,增强Treg细胞抑制功能与抑制CD4+T细胞过度活化；进一步通过表达谱芯片与siRNA干扰实验证实,ICT引起的转录因子STAT5b表达水平升高继而影响Foxp3/IL17a启动子区组蛋白修饰的改变可能是ICT调控Foxp3/IL17a平衡的机制之一；体内给MRL/lpr狼疮鼠喂养ICT,结果发现ICT能够降低MRL/lpr狼疮鼠尿蛋白水平,减少肾脏组织IgG、C3沉积及改善肾脏组织病理损伤。第一部分ICT对SLECD4+T细胞Foxp3/IL17a的调控作用第一节ICT调控SLECD4+T细胞Foxp3与IL17a表达目的：探讨ICT对SLECD4+T细胞Foxp3与IL17a表达水平的影响。方法：免疫磁珠法分离SLE患者外周血CD4+T细胞,用4OuM/LICT刺激CD4+T细胞72h后,采用Real-timeRT-PCR法检测Foxp3与IL17amRNA的表达水平,westernblot检测Foxp3蛋白水平,酶联免疫吸附法(ELISA)检测IL17a蛋白水平。结果：1.与对照组相比,ICT组Foxp3mRNA水平显著升高(对照组vsICT处理组：1±0.0vs2.288±0.3962,P=0.0019),IL17amRNA水平显著下降(对照组vsICT处理组：1±0.0vs0.4077±0.1839,P=0.002)。2.与对照组相比,ICT组Foxp3蛋白水平显著升高(对照组vsICT处理组：0.6167±0.07638vs1.46±0.2254,p=0.0036),IL17a蛋白水平下降(对照组vsICT处理组：41.86±12.82vs30.34±0.7566,P=0.0344)。结论：ICT能够增强SLE患者外周血CD4+T细胞Foxp3表达,降低IL17a分泌。第二节ICT对SLETreg细胞功能与CD4+T细胞自身免疫反应的影响目的：探讨ICT对SLETreg细胞抑制功能与CD4+T细胞自身免疫反应的影响。方法：免疫磁珠法分离SLE患者外周血CD4+CD25+CD127-Treg细胞,CD4+CD25-T细胞,CD4+T细胞,CD19+B细胞。使用40uM/LICT刺激CD4+CD25+CD127-Treg细胞72h后,Treg细胞与CD4+CD25-T细胞1：1共培养5天,采用淋巴细胞增殖试验检测Treg抑制功能,ELISA法检测上清中细胞因子IL10,TGF-p水平。用40uM/LICT刺激CD4+T细胞72h后,CD4+T细胞与自身CD19+B细胞1：4共培养8天,收集细胞与上清,ELISA法检测上清中IFN-γ,IL-6,TNF-α水平以及自身B细胞IgG抗体产量,流式细胞术检测CD4+T细胞表面自身免疫分子CD40L,CD70表达水平。结果：1.与对照组相比,ICT组Treg细胞抑制功能增强(对照组vsICT处理组：33.67±10.97vs63.1±2.265,p=0.0104),差异具有统计学意义。对照组和ICT组Treg细胞体外扩增2周后,细胞数量无明显差异。2.与对照组相比,ICT组IL-10分泌增加(78.19±35.01vs196.2±38.21,p=0.0039),差异具有统计学意义。TGF-p分泌物无显著差异(110.2±3.942cs114.4±5.568,p=0.1626)。3.与对照组相比,ICT组刺激自身B细胞IgG抗体产量显著下降(对照组vsICT处理组：43.14±12.52cs6.476±3.364,p=0.0013),差异具有统计学意义。4.与对照组相比,ICT处理组CD4+T细胞分泌IFN-γ,IL-6,TNF-α水平降低(对照组vsICT处理组：330.6±17.23vs194.56±6.762,P=0.0252；521.6±61.2vs251.1±58.9,P=0.0337；750.2±32.753vs420.6±23.341,p=0.0045),差异具有统计学意义。5.与对照组相比,ICT组CD4+T细胞表面CD40L,CD70表达降低(对照组vsICT处理组：2±0.1vs1±0.2,P=0.029；对照组vsICT处理组：3.6±0.26vs1.46±0.25,P=0.00378)差异具有统计学意义。结论：ICT能够增强Treg抑制功能,抑制CD4+T细胞过度活化及炎性因子的产生。第二部分ICT调控SLECD4+T细胞Foxp3与IL17a表达的分子机制第一节ICT对Foxp3与IL17a启动子区组蛋白修饰的影响目的：探讨淫羊藿对Foxp3与IL17a启动子区组蛋白修饰的影响。方法：采用第一部分第一节预留的标本,染色质免疫沉淀(ChIP)方法结合实时定量PCR(real-timePCR)法检测Foxp3与IL17a启动子区域H3K4、H3K9三甲基化、H4乙酰化水平。结果：与对照组相比,ICT组SLE患者CD4+T细胞Foxp3启动子区H3K4me3的水平显著升高(对照组vsICT处理组：1±0.0vs11.1±3.21,P=0.0081)；与对照组相比,ICT组SLE患者CD4+T细胞IL17a启动子区H3K9me3的水平显著升高(对照组vsICT处理组：1±0.0cs4.367±1.106,p=0.0341)。对照组和ICT组Foxp3/IL17a启动子区H4乙酰化水平无明显差异。结论：ICT通过增强H3K4me3的水平促进Foxp3表达,通过增强H3K9me3的水平降低IL17a表达。第二节ICT刺激后SLECD4+T细胞全基因组表达谱分析目的：通过表达谱芯片了解ICT刺激SLECD4+T细胞后基因组表达水平的影响,并寻找ICT调控SLECD4+T细胞Foxp3与IL17a表达的潜在靶点。方法：免疫磁珠法分离2例SLE患者外周血CD4+T细胞,使用40uM/LICT刺激CD4+T细胞72h后,收集细胞、抽提总RNA,Affymetrix表达谱芯片检测全基因组基因表达差异。采用GO分析以及Pathway分析找到富集差异的GO分类条目与Pathway条目；采用Real-timeRT-PCR法验证挑选出的差异基因。结果：与对照组相比,ICT组共检出3倍以上差异基因1007个,其中上调612个(占差异基因60%),下调395个(占差异基因40%)。GO分析以及Pathway分析发现ICT主要影响免疫反应相关生物过程与信号通路的改变。挑选出的4个差异基因(IRF-4,STAT5a,STAT5b,HIF-1)是能够共同调控Foxp3/IL17a表达的转录因子,Real-timeRT-PCR验证结果显示这4个基因的表达趋势与基因芯片检测结果一致,其中STAT5b显著升高,差异具有统计学意义(1±0vs2.467±0.1508,p=0.0339)。结论：ICT主要下调SLECD4+T细胞免疫相关生物过程与信号通路的基因表达,其中STAT5b可能是ICT调控Foxp3/IL17a的潜在靶点。第三节ICT刺激后STAT5b的改变及其与Foxp3/IL17a的关系目的：探讨干扰STAT5b后,淫羊藿对Foxp3/IL17a表达的调控是否改变。方法：设计针对STAT5的小干扰RNA,电穿孔法瞬时转染活动性SLE患者的CD4+T细胞,再予ICT刺激24h。收集细胞后,用Real-timeRT-PCR及WesternBlot检测STAT5b干扰效果,用Real-timeRT-PCR检测Foxp3与IL17amRNA水平。结果：干扰STAT5b后,ICT组较对照组Foxp3改变无统计学差异(1±0vs1.073±0.07959,p=0.17),IL17a升高,但无统计学差异(1±0vs1.293±0.01839,p=0.18)。结论：干扰STAT5b后,ICT不能调控Foxp3/IL17a表达。第三部分ICT对MRL,/lpr狼疮鼠的治疗作用目的：探索ICT对MRL/1pr狼疮鼠的治疗作用。方法：SPF级别14周龄雌性MRL/lpr狼疮鼠20只,随机分成2组,其中实验组10只,对照组10只。实验组每天喂养ICT(用羧甲基纤维素制成糊状),对照组每天喂养等量溶剂羧甲基纤维素(CMC)。ELISA法检测抗dsDNA抗体,IL-10,TGF-β,IFN-γ水平,尿蛋白试纸检测尿蛋白水平,直接免疫荧光法检测肾脏组织IgG,C3沉积,HE染色检测小鼠肾脏损害情况。结果：1.对照组与ICT喂养组MRL/lpr狼疮鼠抗dsDNA抗体、IL-10,TGF-p,IFN-y水平比较喂养4周后,即小鼠20周龄时,ELISA结果显示,与对照组相比,ICT喂养组抗dsDNA抗体分泌降低(67140±4836vs55080±9596,p=0.0371),差异具有统计学意义；IL-10分泌降低(6441±479.9vs5627±486.6,p=0.0116),差异具有统计学意义；TGF-β分泌无明显改变(110.2±3.942vs114.4±5.568,p=0.1626)；IFN-y分泌无明显改变(493.9±25.94vs497±41.58,p=0.8675)。2.对照组与ICT喂养组MRL/lpr狼疮鼠尿蛋白比较经过4周ICT治疗后,与对照组相比,ICT喂养组尿蛋白显著降低(300±73.02967vs84.2857±38.72105,P=0.0198),差异具有统计学意义。3.对照组与ICT喂养组MRL/1pr狼疮鼠肾脏组织免疫荧光IgG,C3沉积IgG,C3直接免疫荧光结果显示：ICT喂养组狼疮鼠肾小球系膜区着色亮度不清晰,荧光强度较弱,IgG,C3沉积较少；而对照组狼疮鼠肾小球系膜区肾脏着色明显,亮度耀眼,IgG,C3沉积较多。4.对照组与ICT喂养组MRL/lpr狼疮鼠肾脏病理评分HE染色结果显示,与对照组相比,ICT喂养组肾脏病理肾小球评分降低(8.36±1.067vs6.72±0.7935,p=0.0129),差异具有统计学意义；肾脏病理肾小管评分降低(8.16±1.328vs6.04±1.054,p=0.012),差异具有统计学意义。结论：ICT对MRL/lpr狼疮鼠肾脏损害有一定的治疗作用
【作者】廖洁月；
【导师】陆前进；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】淫羊藿素；Foxp3；IL17a；基因表达；调节性T细胞；CD4~+T细胞；细胞因子；H3K4me3；H3K9me3；组蛋白修饰；表达谱芯片；差异基因；STAT5b；电穿孔；转染；MRL/lpr狼疮鼠；直接免疫荧光；HE染色；

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